Разроботка технологии производства инулиназы грибного происхождения
ПОД- СЕКЦИЯ 2. Биотехнологии.
Стойко В.И., асп.
Айзенберг В.Л., к.б.н.
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
Разроботка технологии производства инулиназы грибного происхождения
В современной биотехнологии особенно актуален вопрос активности и специфичности ферментов, исследование их биосинтеза разными продуцентами, изучения физико-химических свойств ферментов, механизм их действия. Решение этих вопросов имеет не только фундаментальное, но и практическое значение с точки зрения рационального использования ферментных препаратов, интенсификации технологических процессов и направленной предварительной обработки растительного сырья при производстве пищевых продуктов и их ингредиентов.
Среди гидролитических ферментов, которые нашли свое применение при переработке растительного сырья, важное место занимают гидролитические ферменты, в частности инулиназы (КФ 3.2.1.7).
Перспективы промышленного использования инулиназы грибного происхождения основаны на свойствах данного фермента осуществлять гидролиз инулина и фруктоолигосахаридов. Интерес к инулиназе обоснован наличием в Украине дешевого доступного инулинсодержащего сырья (топинамбур, цикорий). Инулиназа может быть использована для получения фруктозы и определение ее содержания в пищевых продуктах, при получении фруктозо-глюкозного сиропа, в питании больных диабетом, при производстве молочной кислоты, этилового спирта и т.д.
В Украине отсутствует технология производства инулиназы. Потребности биотехнологической промышленности в этих препаратах удовлетворяются за счет ферментов зарубежного производства. Поэтому поиск отечественных продуцентов инулиназы и изучение ее свойств важных для технологического использования является актуальной задачей.
Впервые в Украине проведен скрининг продуцентов инулиназы среди коллекционных штаммов микроскопических грибов отдела физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины. Было проверено более 300 коллекционных культур 106 видов 39 родов микромицетов. Селекционированы два новых эффективных штамма Penicillium aculeatum 225 (мезофил) и Aspergillus sp. 8ТХ (термотолерантная культура), которые имели высокие показатели инулиназной активности [1; 2, c. 48].
Изучен ряд морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств отобранных штаммов. Полученные данные о влиянии различных источников углерода, азота и фосфора на биосинтез ферментов позволили подобрать состав питательных сред для выращивания соответствующих микромицетов и разработать условия их культивирования. В ряду источников углеродного питания лучшими оказались соответственно жмых топинамбура (для P. aculeatum 225) и порошок цикория (для Aspergillus sp. 8TX), азотного – азотнокислый калий и хлорид аммония (рис. 1).
а) б)
Рис. 1. Влияние различных источников углерода (а) и азота (б) на активность инулиназы P. aculeatum 225 и Aspergillus sp. 8TX
Установлены оптимальные условия культивирования для штаммов-продуцентов: P. aculeatum 225 – температура 20 ˚С, объем питательной среды 150 мл, при скорости перемешивания 160 об/мин; Aspergillus sp. 8TX – температура 28 ˚С, скорость перемешивания 220 об/мин, объем среды 150 мл. В результате была повышена экзоинулиназная активность исследованных штаммов в 9 – 11 раз (около 20 – 30 ед/мл) [3, c. 26].
Определена активность сопутствующих ферментов: инвертазы, амилазы, липазы, протеазы, пектолитических и целлюлолитических ферментов. Культура Aspergillus sp. 8TX образует мультиэнзимный комплекс ферментов. Штамм-продуцент P. aculeatum 225 синтезирует преимущественно инулиназу с незначительным количеством сопутствующих ферментов.
Изучено влияние трех органических растворителей (ацетона, этанола, изопропанола) и их концентрации на процесс выделения инулиназы из культурального фильтрата P. aculeatum 225. Оптимальным вариантом было использование этанола в объемном соотношении культуральная жидкость-растворитель 1:3,5. При таких условиях достигался высокий выход препарата инулиназы 79,3% со степенью очистки 1,55 [4, c. 77].
Экспериментально доказана возможность применения ультрафильтрации для концентрирования и очистки культурального фильтрата культур P. aculeatum 225 и Aspergillus sp. 8TX. Использование полисульфоновой мембраны UH-030P позволяет сконцентрировать препарат культуральной жидкости в 3-4 раза, причем показатель инулиназной активности для P. aculeatum 225 составил 72,2 ед/мл (удельная активность 6,07 ед/мг) и Aspergillus sp. 8TX – 64,9 ед/мл (удельная активность 4,87 ед/мг). Потери активности фермента при ультрафильтрации составили 12-14% [4, c. 77].
Изучено влияние рН и температуры на активность фермента [4, c. 77]. Инулиназа исследованных микромицетов проявляла активность в диапазоне значений pH от 5,0 до 6,0, достигая своего максимума при значениях pH близких к 5,0. Полученные экспериментальные данные о влиянии температур на активность фермента свидетельствуют о достаточно высокой термической стойкости инулиназ селекционированных микромицетов. Оптимальная температура действия инулиназы P. aculeatum 225 составила 65 ˚С. Инактивацию инулиназы Aspergillus sp. 8TX наблюдали при температуре 60 ˚С и выше (рис. 2).
а) б)
Рис. 2. рН-оптимум (а) и температурный оптимум (б) действия инулиназы
На основании экспериментальных данных разработана технологическая и аппаратурная схема производства гидролитического ферментного препарата Инулакулеатина Г2Х. Были проведены стендовые исследования процесса культивирования штамма гриба P. aculeatum 225 в полупроизводственных условиях и установлены оптимальные режимы культивирования.
Литература:
1. Пат. 42451 Україна, МПК7 C 12 N 9/24, C 12 N 1/14. Штам гриба Penicillium aculeatum Raper et Fennell 225 – продуцент інулінази / Айзенберг В.Л., Захарченко В.О., Стойко В.І., Жданова Н.М., Курченко І.М., Капічон Г.П.; заявник та власник Інститут мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАНУ. – № 200815008; заявл. 25.12.2008; опубл. 10.07.2009, Бюл. № 13.
2. Стойко В.І., Жданова Н.М., Айзенберг В.Л., Капічон Г.П. Скринінг мікроміцетів – продуцентів інулінази // Біотехнологія. – 2010. – Т. 3, № 2. – С. 48–55.
3. Стойко В.І., Жданова Н.М., Айзенберг В.Л., Капічон Г.П. Вплив умов культивування на синтез інулінази Penicillium sp. 225 // Наукові праці НУХТ, 2011. – № 37, 38. – С. 26–30.
4. Стойко В.І., Жданова Н.М., Айзенберг В.Л., Капічон Г.П. Виділення інулінази з культуральної рідини Penicillium sp. 225 та характеристика її фізико-хімічних властивостей // Біотехнологія. – 2011. – Т. 4, №5. – С. 77–82.
