РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ДНК УТОК

 

Под-секция 7. Генетика.

Темирбекова Г.А.

кандидат сельскохозяйственных наук,

ТОО «Северо-Казахстанский НИИ животноводства и растениеводства»

РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ

МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ДНК УТОК


Современные методы молекулярной генетики предназначены для выявления особенностей в структуре ДНК. Последовательность нуклеотидов ДНК имеет индивидуальные особенности у каждого живого организма, кроме однояйцевых близнецов или клонированных организмов. Развитие ДНК-технологий позволило сформировать целое направление в селекции – селекция с помощью маркеров (marker assistant selection – MAS), поскольку молекулярно-генетические методы позволяют идентифицировать аллельно варианты генов, ответственные за некоторые количественные признаки сельскохозяйственных животных.

Важной проблемой генетики и племенного дела является изучение взаимодействия генотипа и среды, а также некоторых биохимических показателей с продуктивностью птицы. Изучение этого вопроса позволит решить  проблему использования птицы в разных условиях среды и прогнозировать их продуктивность.

Селекция по генотипу имеет преимущества перед традиционными методами. Она не учитывает изменчивость хозяйственно-полезных признаков, обусловленную внешней средой, делает возможным оценку животных в раннем возрасте независимо от пола животных и, в конечном итоге, повышает эффективность  селекционной работы. 

Поскольку фенотип гибридов зависит не только от величины продуктивности родительских форм, но и от степени их генетических различий, выбранный метод позволит получить дополнительную информацию о степени разнообразия селекционного материала (межлинейные, внутри- и межпородные различия), что поможет дальнейшему рациональному планированию работы с имеющимся генофондом.

В настоящее время при проведении генетического мониторинга сельскохозяйственных популяций по данным ряда авторов, отчетливо прослеживается тенденция утраты генетического разнообразия. Поэтому, наряду с классическими зоотехническими приемами, включающими индивидуальный и групповой отбор по хозяйственно важным признакам продуктивности, практическая селекция должна следить за сохранением оптимального генного разнообразия и динамикой генетической изменчивости, количественная оценка которой может быть получена при изучении ДНК - маркеров. Одной из таких групп является ДНК митохондрий. [1, с. 221]

Митохондриальная ДНК позвоночных формально можно причислить к повторяющейся, поскольку клетка содержит сотни митохондрий, а каждая митохондрия – от 2 до 10 копий молекул ДНК. Особенностью митохондриального генома является очень плотное расположение генов: многие гены расположены встык, а имеющиеся межгенные промежутки состоят из одного или нескольких нуклеотидов. Такое плотное расположение характерно лишь для митохондриального генома человека и большинства позвоночных животных и нигде больше не встречается.

Наследуется митохондриальная ДНК практически только от одного из родителей (в большинстве случаев является нейтральным маркером материнской линии), а также в ней точечные мутации закрепляются в значительной степени, чем в ядерной ДНК.

Вариабельность различных участков митохондриальной ДНК увеличивается в ряду: гены рРНК, гены тРНК, гены трех субъединиц АТФазы и семи субъединиц НАДН-дегидрогеназного комплекса, последовательность D-петли. Эволюционная изменчивость митохондриальных генов, кодирующих синтез белков, также неодинакова. Наиболее консервативным является ген субъединицы I цитохромоксидазы, а гены субъединиц 5 и 6 НАДН-дегидрогеназного комплекса и субъединицы 8 АТФазы характеризуются наибольшей изменчивостью в процессе эволюции организмов. [2, с. 59]

Целью нашей работы является анализ изменчивости митохондриальной ДНК и определение генетической дифференциации внутрипородных линий уток ТОО «Бишкульская птицефабрика».

В митохондриальном геноме изучали полиморфизм длин рестрикционных фрагментов  в участке, кодирующем вторую субъединицу НАДН – дегидрогиназы (участок ND2). Нуклеотидная последовательность этого участка была получена из базы данных «Genome Data Base» (Internet). Участок имеет длину 1057 пн и содержит несколько сайтов рестрикции для эндонуклиаз рестрикции Alu I (AG^CT; TC^GA), Dde I (C^TNAG; GANT^C), Hae III (GG^CC; CC^GG), Hinf I (G^ANTC; CTNA^G).

Кровь для выделения ДНК брали из подкрыловой вены. В качестве консерванта использовали стерильный раствор глюгицира. ДНК выделяли по стандартному методу с использованием лизиса клеток крови 10%-ным SDS в присутствии протеиназы К и депротеинизацию фенол-хлороформом и последующим осаждением этанолом.

 Праймеры, использованные для амплификации ND2-участка митохондриального генома уток имели последовательность:

NMG-1-a     5¢ -ACC-CCA-GTC-CTA-GTC-CTC-AGT-CTC- 3¢

HMG-1-b     5¢ -CTT-CGG-TTT-AGG-TGG-GTG-TTA-TCC- 3¢

Для рестрикционного анализа участка ND2 использовали 4 эндонуклеазы рестрикции Alu I (AG^CT), BstDE I (прототип DdeI - C^TNAG), Hae III (GG^CC) и HinfI (G^ANTC). 8,5 мкл. амплифицированного образца инкубировали в течение 12 часов с 2,5 мкл рестриктазы  в соответствующем с использованием ТВЕ-буфера, окрашивали бромистым этидием и выявляли в УФ – свете. Изображения гелей фиксировали с помощью видеосистемы и прилагаемого к ней программного обеспечения. В качестве маркёров молекулярной длины использовали маркёрные наборы фирмы «Сибэнзим» PBR322/AluI  и pUC19/MspI.

Результаты амплификации сегмента ND2  митохондриальной ДНК, расположенного между участками, гомологичными праймерам 1 и 2, у исследованных внутрипородных линий уток, показали наличие продукта ПЦР длиной 1057 пн.

Полиморфизм митохондриальной ДНК находит все более широкое применение  в популяционно-генетических и микроэволюционных исследованиях благодаря особенностям ее структурной организации: большому размеру, материнскому типу наследования без рекомбинаций. Поэтому анализ полиморфизма митохондриальной ДНК позволяет во многих случаях получить четкое представление об уровне гетерогенности и генетической дифференциации изучаемых популяций.

При анализе рестрикционного полиморфизма участка ND2 митохондриального генома уток, проведенного с различными рестриктазами у всех исследованных линий выявляются как общие, так и специфические фрагменты. По каждой рестриктазе рассчитаны коэффициенты генетического сходства и построены дендрограммы. Наиболее объективной представляется характеристика филогенетических отношений, данная на основе усредненных индексов генетического расстояния. 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях /Ю.П. Алтухов. М.: ИКЦ “Академкнига”, 2003.
  2. Минченко А.Г., Дудырева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1990.